从技术上看，分子诊断领域主要包括pcr（传统pcr、qpcr和dpcr）、荧光原位杂交（fish）、基因芯片和第二代高通量测序技术（ngs）等。其中，pcr是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台，在国内分子诊断中市占率高达40%；其次是分子杂交技术，占比为35%。
1. 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）
上世纪八十年代，cetus corporation公司的化学家kary mullis发明了pcr，对分子生物学乃至整个生命科学界产生了巨大的推动作用。从此以后，基于pcr的dna扩增技术逐渐成为生物学研究的基础，开启了一个又一个生命科学领域的重大课题。目前，pcr在传染性疾病（细菌、真菌、病毒、支原体）诊断、nipt、干细胞研究、生物标志物开发等方面有着极为广泛的应用。
pcr是指在dna多聚酶（又称“dna聚合酶”，如taq dna聚合酶）催化条件下，以母链dna为模板，以特定引物为延伸起点，通过高温变性（94℃）、低温复性（55℃）、中温延伸（72℃）等步骤，在体外复制出与母链模板dna互补的子链dna的过程。pcr是生物体外的特殊dna复制，最大的特点是能将微量的dna大幅扩增。
图：pcr原理
与杂交技术、高通量测序技术相比，pcr技术主要优势在于高灵敏度、易于推广，主要局限在于检测位点单一且已知，多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限。但从短期来看，pcr技术仍将是分子诊断主流技术平台。
pcr技术自问世以来，经历了三十余年的高速发展，目前已经成为世界上应用最成熟、市场份额最大的分子诊断技术平台。研究者们在该技术原理基础之上开发出一系列衍生的分子检测技术，主要可以分为三类：第一代pcr电泳法、第二代荧光定量pcr（qpcr）和第三代数字pcr（dpcr）。
1.1 pcr电泳法（传统pcr）
pcr电泳法是最原始、最简单的基于凝胶的低通量pcr方法，是指在pcr反应结束之后，通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法，利用长波式紫外灯照射或放射自显影技术对pcr扩增产物进行定性检测分析的dna检测方法。但pcr电泳法本身只能做定性检测而无法定量，因为该反应产出的dna量不一定能反映最初情况，例如不同样品和序列的扩增效率是有差异的。此外，还存在交叉污染、检测耗时长等缺点，目前处于衰退期，基本上已被淘汰。
图：pcr电泳条带图
1.2 qpcr电泳法（荧光定量pcr）
qpcr是利用插入性染料或荧光探针对pcr产物进行标记跟踪，通过监控整个pcr过程中荧光信号的强度变化得到待测dna样本初始浓度的相对定量分析方法。该方法相较于传统pcr方法而言，无需取出pcr产物进行分离，且可作定量分析，并具有特异性强、灵敏度高、自动化程度高、无污染等优势，目前已逐渐取代常规pcr，成为应用最成熟、临床应用最广泛的分子诊断技术平台。
图：pcr标准曲线定量分析待测dna样本浓度
根据引入荧光基团的不同，qpcr可分为荧光探针法定量pcr和荧光染料法定量pcr。
荧光探针法定量pcr的原理为：在pcr反应体系中，加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在dna任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；pcr扩增时，taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步，这就是定量的基础所在。
荧光染料法定量pcr的原理为：在pcr反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链dna小沟结合并发射荧光信号，并不与单链dna链结合，而且在游离状态不发出荧光，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步，此即定量的基础所在。
qpcr在国内外均为分子诊断临床应用最广泛的技术平台，尤其是在感染性疾病（hbv、std等）和肿瘤伴随诊断领域，目前仍以qpcr技术平台为主。据不完全统计，截至2020年5月11日，国家药监局（nmpa）共批准了806个pcr类产品，其中荧光定量qpcr产品占比高达85.11%。在伴随诊断领域，nmpa获批的伴随诊断产品中有60%都是基于qpcr技术，而fda批准的39个伴随诊断产品基于qpcr技术的产品占比也高达38.46%（15个）
1.3 dpcr（数字pcr）
dpcr是新兴起来的一种核酸分子绝对定量技术，主要采用当前分析化学热门研究领域的微滴化方法，对待测样本进行高倍稀释，分配到不同的反应单元内，每个单元或不含有、或含有一至多个目标分子（dna模板），再将所有反应单元内的样本进行pcr扩增，最后结合泊松分布原理，分析软件根据阳性分子个数与比例得出靶分子的起始拷贝数（copies）或浓度（copies/ul）。与qpcr相比，dpcr具有绝对定量、高灵敏度、可耐受pcr反应抑制物、减弱背景序列干扰信号等显著优势。
dpcr在国内尚处于市场导入期，目前仅有南京科维思生物的her2基因扩增检测试剂盒（数字pcr法）获批，在肿瘤伴随诊断、肿瘤早筛、传染病检测、nipt、药物基因组学等领域具有较大临床应用潜力和优势。根据沙利文数据显示，中国dpcr行业市场规模从2013年的14.6亿元增加至2017年的72亿元，cagr达到29.2%，到2022年市场规模预计将达到266.6亿元。
2. 荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization，fish）
fish是一种按照核酸碱基互补配对原则，利用荧光素标记的、已知序列的dna探针直接原位杂交到待测dna样本模板上，经荧光检测系统和图形分析技术对待测dna序列进行定位、定性和相对定量的技术。fish主要用于指导肿瘤靶向药物使用、肿瘤预后、肿瘤疾病分型诊断、nipt等领域，是检测her-2基因（一种原癌基因）状态的金标准，目前在国内发展较为成熟，且国内大多数省份和地区均已将其纳入医保。
fish操作流程为：首先用荧光素（直接标记法）或“生物素-荧光素标记亲和素”放大系统（间接标记法）标记探针核苷酸，利用切口平移法或随机引物法制备出带有荧光标记的、已知序列的dna探针。在高温条件下使该探针与待测dna样本模板发生变性并打开双链，令两者混合杂交并形成杂交体，最后通过荧光显微镜进行观察，从而实现对目标dna的定性、定位和相对定量分析。
3. 基因芯片技术
基因芯片技术又称dna微阵列技术，是将大量荧光或酶标记的、序列已知的dna探针集成在同一芯片上与样品分子进行杂交，通过采集荧光或化学发光信号获得样本序列信息。基因芯片技术可看作是fish与芯片技术的结合，可以实现对大量目标基因同时进行检测，具有成本相对较低、检测效率较高的优势，主要应用于消费级基因检测、病毒分型、耐药突变位点检测、遗传基因和肿瘤基因检测等领域。
ngs又称为下一代测序技术，是指通过模板dna分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在dna聚合酶链反应或dna连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读。ngs最显著特征是高通量，一次性可完成几十万至上百万条序列的测定，使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。该技术不需要荧光标记的核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
罗氏454生命科学公司于2007年推出的gs flx测序系统，是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。
随着ngs技术进步和测序成本的降低、肿瘤医生和病人对ngs检测认知不断完善、测序服务对象和应用细分领域的拓展、企业间合作的增加，ngs有望迎来快速发展。根据美国 markets and markets报告显示，预计全球高通量基因测序市场规模将从2019年的78亿美元增加至2025年的244亿美元，cagr为20.9%。