一、crispr/cas简介
crispr的全称是clustered regularly interspaced short palindromic repeats（成簇规律间隔的短回文重复序列），形如其名，crispr 序列结构正是成簇的规律间隔的短回文重复序列，该序列与crispr associated（cas）蛋白组成crispr/cas系统。crispr/cas系统是原核生物的一种自我保护机制，也是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。crispr 诊断被称为下一代分子诊断技术，主要利用 rna 来检测血液或尿液等生物液体中的生物标志物，包含样本前处理（含预扩增）、靶标识别、信号释放和检测几部分。在适应阶段，细菌通过cas蛋白（cas1和cas2）捕捉入侵的外来核酸，并整合至自身基因组的crispr 序列中形成记忆功能，以便下次出现入侵时，细菌可启动免疫反应；在表达阶段，crispr 序列转录生成前体crrna (pre-crrna)和反式激活rna(trans-activating crrna, tracrrna)，pre-crrna通过加工，形成含有与外来基因序列匹配的crrna，crrna与tracrrna通过碱基配对形成向导rna（single-guide rna，sgrna），用于cas蛋白的募集；在干扰阶段，sgrna引导cas蛋白定位到与其同源的外来核酸靶标，并激活cas蛋白的内切酶活性，对靶标核酸进行切割，从而发挥免疫功能。crispr在1987年首次被发现, 直到最近几年crispr-associated(cas)诊断技术得到的广泛应用，离不开两位大牛，麻省理工的张锋和加州大学伯克利分校的jennifer doudna。两人不但在crispr基因编辑上做出奠基性贡献，也对crispr在分子诊断行业的应用做了开拓性工作。正是两位大牛在2015~2018这四年的你来我往交锋中，开启了crispr分子诊断这一全新领域。国外最早于2016年发现的酶是cas13 跟 cas12a的酶，并在2018年发表基于cas13 跟 cas12a的酶的检测技术。2020年的诺贝尔化学奖颁给了crispr的奠基者emmanuelle charpentier和上面提到的jennifer doudna，crispr技术被誉为会改变和造福人类的发明。crispr/cas技术在基因治疗、合成生物学，疾病模型和科学研究方面的应用如爆发的火山，一发不可收拾。2022年，nature发布年度值得关注的技术榜单，其中crispr-cas诊断检测被列为其中之一，通过cas12酶或者cas13酶的特征，可检测广泛的病原体，乃至有效地诊断其他非感染性疾病。目前国内外的公司借助crispr检测技术已经可以在30分钟内实现针对病原的快速、准确的检测。迄今为止，基于crispr的诊断主要应用在传染病的检测。2022年8月4日，伦敦帝国理工学院和博德研究所的研究人员开发了一种易于使用的 crispr 检测技术，这项新检测技术通过检测生物标志物，在室温下能够更快地诊断心脏病和癌症等非传染性疾病，且操作简便。相信假以时日，crispr 检测技术在遗传性疾病、其它非传染性疾病和癌症检测上一定会大放异彩。2015年，上述两个团队发现了crispr的新酶，可以进行非特异性的切割，crispr检测技术便由此展开。
crispr诊断的原理就是：当待检体系中存在靶标核酸时，cas蛋白在向导rna的引导下特异识别靶标序列，形成复合物，进而被激发出针对单链rna的“附带切割活性“，将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成检测过程，通过检测体系是否发光来判断靶标核酸是否存在。crispr/cas系统反式切割活性的检测技术所用的cas蛋白主要有cas12、cas13和cas14，这类蛋白除了具有特异性切割靶序列的功能外，在激活状态下，还具有非特异性切割其它核酸序列的功能。在没有激活的状态下，cas蛋白保持沉默，不会胡作非为；一旦被激活，便会进行非特异性切割其他携带荧光信号的核酸序列，也就是对非靶标核酸进行切割，像一个没有感情的收割机，高举镰刀，看到韭菜就要割，被割下的一茬茬绿油油韭菜，释放荧光信号，即是可用来检测的信号。
cas12在crrna引导下即可识别靶标dsdna，并靶向富含t的pam位点，对靶序列进行特异性切割，同时附带非特异性切割ssdna的活性。靶标核酸经等温（rpa或lamp）扩增富集，然后扩增产物与cas12-crrna结合，激活cas12的附属切割功能，对ssdna荧光探针进行切割，释放荧光基团，形成检测信号。
cas13是一种rna引导的rna核酸内切酶，可在crrna的引导下特异性切割单链靶标rna，并在完成切割后，可继续保持活性并切割其他非靶标rna。靶标核酸经等温扩增技术rpa扩增并引入t7启动子序列后，再利用t7 rna聚合酶转录形成ssrna，转录产物与cas13a-crrna结合，激活cas13a核酸酶活性，切割ssrna荧光探针，释放可被检测的荧光基团。基于cas蛋白的这个特点，张锋和jennifer doudna各自创立了对应的体外诊断公司，专注于开发与crispr/cas系统相关的体外诊断技术及产品。三．未来可期
crispr/cas系统具有作为疾病和病原体检测诊断工具的潜力。大多数已报道的 crispr/cas生物传感系统具有高分辨率（单碱基分辨率）、高灵敏度（达到amol 级）、低成本（ 1美元以下）、操作简易（裸眼判读的试纸）、易储存（室温下储存一年以上）的优点。
具有反式切割活性的三种cas蛋白（cas12、cas13和cas14）被激活后，可对非靶标核酸进行切割，将检测信号进一步放大，提高了检测灵敏度，同时grna对靶序列的特异性识别，进一步提高了检测特异性，使得crispr/cas诊断系统具有高灵敏度、高特异性的特点。不同特性cas蛋白的发现，丰富了检测核酸类型的选择，从dsdna到ssdna再到rna，均可作为crispr/cas分子诊断系统的靶序列，结合层析技术等显色反应，还可实现检测结果的可视化，为分子poct领域的应用场景带来了无限可能。
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作为一种可特异性识别靶序列，具有催化放大信号功能，可直接对靶标序列进行检测的技术，按目前的检测方法，大多需要预先扩增 rna 靶标来放大信号，这增加了操作步骤，耗时也更长了。
另外crispr/cas系统的反式切割活性具有随意性，对实现定量和多靶标检测有一定难度。现有cas蛋白大部分依赖于pam序列发挥作用，对靶标序列的选择受到限制。作为一种基因编辑技术，其脱靶效应的存在也会影响到诊断结果的准确性。
但是，crispr/cas系统作为下一代诊断技术的引领者，相信国内外研究者能改进驾驭这个技术，使其更趋近于理想的诊断技术。未来可期！
参考资料 :https://mp.weixin.qq.com/s/2jqr5eth1trgy1wdpvpyrg;https://mp.weixin.qq.com/s/20alfr-wmvtwuzxn8p2vpq
